體視顯微鏡樣品制備五步法：從固定到成像的全流程解析

作為宏觀觀察利器，體視顯微鏡以立體成像、大景深、寬視野著稱，廣泛應用于質檢、生物解剖、工業檢測等領域。其樣品制備雖不如電子顯微鏡復雜，但仍有五大關鍵步驟直接影響成像效果。本文基于Leica、Olympus等設備使用規范，系統梳理從樣品固定到三維合成的全流程。

一、樣品固定：穩定性與可視化的平衡術

固定方式選擇

微型樣品：導電膠粘貼法（銀膠/碳膠）

脆弱樣品：瓊脂糖包埋法（1%濃度凝膠）

三維樣品：昆蟲針定位+蠟封固定

避免使用油性膠水（易反光）

固定角度優化

昆蟲標本：腹面朝上+45°傾斜

電子元件：引腳朝上+標簽標注

植物組織：切面朝上+甘油保濕

二、擺放定位：空間層次感的營造

景深控制技巧

多層樣品：階梯式擺放（每層間隔>5mm）

高矮樣品：泡沫塊墊高法

景深計算公式：DOF=2λ/(NA)2（λ=波長，NA=數值孔徑）

背景處理

反光樣品：消光漆噴涂（啞光黑）

透明樣品：襯背染色（亞甲基藍溶液）

吸光樣品：環形LED補光

三、照明優化：光影魔術的**調控

光源選擇矩陣

光路調節

暗場觀察：關閉透射光+側光45°入射

偏振光：添加偏振片消除反光

漫反射光：磨砂玻璃濾光片

四、圖像處理：從二維到三維的躍升

景深擴展技術

焦點堆疊法：拍攝15-20張不同焦面照片

軟件推薦：Helicon Focus（自動融合）

參數設置：重疊率70%+步進1μm

三維合成

多角度拍攝：每30°拍攝一張（共12張）

軟件處理：Agisoft Metashape生成點云

輸出格式：OBJ/STL/PLY通用格式

五、特殊樣品處理技巧

液體樣品

密封艙法：使用透明比色皿

懸浮顆粒：添加甘油增加黏度

避免氣泡：真空泵脫氣處理

溫度敏感樣品

低溫臺：液氮冷卻至-196℃

加熱臺：PID溫控±0.5℃

相變觀察：緩慢升溫（0.5℃/min）

常見失敗案例警示

案例1：未固定昆蟲翅膀導致觀察時移動
改進方案：昆蟲針+軟蠟固定

案例2：金屬部件反光嚴重
優化策略：環形偏振光+消光漆處理

案例3：景深不足導致部分結構模糊
解決方案：焦點堆疊+后期融合

結語：讓宏觀世界躍然屏上

體視顯微鏡的樣品制備是"微觀雕塑"與"光學魔術"的結合。建議建立標準化制備流程，記錄關鍵參數（如光源角度、固定方式）。